광합성 색소의 분리 (Paper Chromatography)

실험 방법
 1) 여과지를 17 x 2cm 되게 짜른다. 여과지의 한 쪽 끝에서 2cm 되는 곳에 연필로 선을 긋는다.
 2) 모세 유리관으로 엽록소 추출액을 연필로 그은 선 중앙에 점적한다.
     점적할 때 가장 작은 원이 되도록 4회 점적한다.
 3) 전개용매가 있는 챔버에 여과지를 0.5cm 정도 잠기게 넣는다.
 4) 전개액이 위에서 0.5cm 정도 못 미치는 구간이 올 때 재빨리 꺼내어 전개된 부분에 연필로
     선을 긋는다.
 5) 점적한 부분에서 제일 가까운 곳에 노랜색을 띤 초록색 밴드가 엽록소b(chlorophyll b),
     바로 그 위의 푸른색을 띤 초록색 밴드는 엽록소a(chlorophyll a),
     그 위 쪽으로 몇개의 크산토필(xanthophyll) 밴드가 있으며
     가장 위쪽의 노란색 밴드는 카로틴(carotene) 이다.


 -Paper chromatography-

 분배 크로마토그래피에 의한 분리는 두가지 종류의 서로 혼합되지 않은 용매 사이에서 혼합물들이
두 용매에 의한 분배계수 (patition coefficient)가 다른 원리를 사용한다. 한 용매는 정지상(stationary phase), 다른 용매는 이동상(mobile phase)의 역할을 하여 물질을 분리한다.
 
 이런 분배 크로마토그래피의 일종인 종이 크로마토그래피(Paper chromatography)는 거름종이에 흡착된 용매(물)는 정지상, 물과 섞이지 않는 유기용매는 이동상이다. 그리고 거름종이는 정지상의 지지체(supporting medium)가 된다.
 종이 크로마토그래피는 5μg 이하의 아주 미량의 물질을 정성적으로 확인하는데 유용하다.
 혼합물인 시료의 용액을 거름종이 위에 점적하고 말린 다음 물로 포화된 유기용매 속에 그 한쪽 끝을 담가두면, 용매는 모세관 현상에 의해 종이 위쪽으로 올라가는 상승식 전개법(ascending method), 또는 중력에 의해 아래쪽으로 내려오는 하강식 전개법(descending method)으로 이동하게 된다.
 이 때, 시료의 성분들도 용매와 함께 따라 이동하게 되는데 이동하는 동안에 물과 유기용매에 대한 용해도의 차이 (분배계수)에 따라 이동속도가 다르다. 이동상에 잘 녹는 물질은 많이 전진하고 정지상에 잘 녹는 물질은 많이 전진 하지 못한다.
 각 성분의 이동거리는 Rf값으로 나타낸다.

 Rf = 시료의 이동거리 / 용매의 이동거리

 어떤 한 성분의 Rf 값은 같은 조건에서는 일정하지만 온도, 용매의 pH, 거름종이 및 용매의 종류에 따라 Rf 값은 달라진다.

 엽록소 a 와 엽록소 b가 모든것은 똑같으나 한 부분에 -CH3 그룹과 -CHO 그룹 중 어느것이 붙느냐에 따라 나뉘는데, 이 종이크로마토그래피는 엽록소 a 와 b를 분리할 수 있다.


광합성 색소들의 공식적인 Rf 값은 다음과 같다.

Carotene (카로틴)	0.95
Xantophyll (크산토필)	0.85
Chlorophyll a (엽록소 a)	0.36
Chlorophyll b (엽록소 b)	0.21