그람 염색법 (Gram staning Method)

각종 균을 염색하여 현미경적으로 관찰하며, 감염질환의 조기 진단에 이용되는 그람 염색(Gram staning)은 1884년 Hans Chistian Gram(덴마크 세균학자, 1853-1938)에 의해서 처음 개발된 방법이다.

이후 여러가지 방법이 제안되었으며, Hucker의 방법과 Burke의 방법이 일반적으로 사용된다.

세균을 crystal violet의 염료로 염색시킨 후 알코올이나 아세톤으로 탈색시켜 crystal violet의 색인 자주색이 탈색되면 Gram-negative(그람 음성), 자주색이 남아있으면 Gram-positive(그럄 양성)으로 정의한다.

그람 염색은 기본적으로 4단계로 구성된다.

제 1단계                  crystal violet 염색	자주색의 염기성 색소인 crystal violet으로 염색을 하면 그람 양성균과 그람 음성균 모두 자주색으로 염색된다.
제 2단계                    착색 단계 (매염)	1단계에서 염색된 세균에 요오드 용액을 처리하면 crystal violet과 Iodine이 반응하여 세포 내에 불용성의 복함체를 형성한다.  그람 양성균 및 음성균 모두 여전히 자주색으로 보인다.
제 3단계                           탈색	착색된 세균에 탈색제인 알코올(아세톤) 시약을 처리하면 착색된 복합물이 용해된다. 그람 양성균은 복합물이 남아 자주색으로 보이고, 그람 음성균은 탈색되어 백색으로 보인다.
제 4단계                        대조염색	분홍색의 염기성 색소인 Safranin으로 대비염색을 하면 백색으로 탈색되었던 그람 음성균은 분홍색으로 염색된다.  그러나 그람 양성균은 영향을 받지 않고 그대로 자주색으로 보인다.

 이 그람염색은 각 세균의 세포벽의 성분과 구조에 따라 다르게 나타난다.

 그람 양성균의 경우 세포벽이 두꺼운 peptidoglycan layer와 풍부한 teichoic acid로 이루어져 있어 탈색제로 탈색을 해도 쉽게 탈색되지 않아 crystal violet이 계속 세균 세포 내에 남아 자주색으로 염색된 채로 남아있는다.

하지만 그람 음성균은 peptidoglycan layer이 단일층으로 되어있고 세포벽이 phospholipid, lipopolysaccharate, lipoprotein 등으로 이루어져 있어 탈색제에 의해 crystal violet와 Iodine 복합체가 쉽게 탈색되며 대조 염색약인 Safranin O로 염색, 붉은색을 나타낸다.

그람 양성이 음성으로 나올 수 있는 경우는 다음과 같다.
 1) 처음 세포를 고정할 때 지나치게 강한 열처리를 할 경우
 2) 알코올로 탈색을 너무 오래하거나, 세척을 너무 강하게 할 경우
 3) 24시간 이상 배양된 세포, 대수기가 아닌 정상기나 사멸기의 상태에 있는 오래된 세균
 4) 세균 자체의 특성으로 crystal violet-Iodine 복합체를 가두는 능력이 약한 그람 양성균.

< 그람 음성균 >

 그람염색법으로 염색하였을 때 자주색은 탈색되고 Safranin으로 붉게 염색되는 세균.
그 종류로는 살모네라균, 이질균, 티푸스균, 대장균, 콜레라균, 페스트균, 임균, 수막염균, 스피로헤타 등이 포함된다.
일반적으로 트리페닐메탄계나 아크리플라빈 색소에 대한 저항력이 강하고 계면활성제에도 내성이 강하다. 또 생존에 필요한 영양요구가 간단하여 단순한 구성의 배양액에서도 잘 자라며, 독소는 균체내 독소로 가열에 의해서도 잘 파괴되지 않는다. 균체 항원의 주체가 되지만 면역성은 약하다.

< 그람 양성균 >

 그람 염색법에 의하여 자주색으로 변하는 세균.
 즉, 포도상구균, 연쇄상구균, 폐렴균, 나병균, 디프테리아균, 파상풍균, 탄저균, 방선균 등이 여기에 속한다.
색소나 약제에 대한 감수성이 높으며, 대사 작용에는 아미노산과 비타민을 필요로 한다. 균체외 독소를 방출하는데 이 독소의 독작용은 균종에는 강력하지만 가열하게 되면 쉽게 파괴된다.
이 독소는 생체내에서 항원성이 높고, 생성된 항체는 독소와 결합하여 그 독성을 중화시키는 특이성을 가지고 있다. 그 밖에 외독소에 포르말린을 작용시키게 되면 독성은 없어지고 항체만 남게 되므로 면역원으로 이용할 수 있다.